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培养基的配制注意事项

  1. 培养基的配制注意事项

  植物组织培养最常用到MS培养基,包含十几种化合物。因为有些化合物相遇会发生化学反应产生沉淀,影响培养基的营养成分,准备MS培养基需要配制多种高倍母液。且配制母液时,尤其涉及大量元素的母液时,一定要等一种成分溶解之后,再缓慢的添加另一种成分,切记“一锅煮”,即不能将各种化合物一齐添加进去。可选用Coolaber的MS培养基基盐(PM1011)在自行加入蔗糖和琼脂配制MS培养基,既经济,更高效。

  2. 灭菌后培养基不凝胶或者凝胶偏软

  植物凝胶、琼脂都对酸性条件敏感,pH值低于5很难成胶或凝胶偏软,切记高压灭菌前调节培养基pH值(5.5-6.0)。植物凝胶对二价阳离子浓度有要求,也就是相对于MS培养基,1/2MS培养基中植物凝胶要适当增加用量。另外灭菌后,倒出培养基前一定将培养基摇匀(带防烫手套),因为是琼脂密度大底层含量高,容易造成培养基强度不均匀。选择Coolaber改良MS培养基(PM10121,pH5.8±0.2)含蔗糖和琼脂/植物凝胶,可以省去调pH步骤。

  3. 水解酪蛋白有酸水解和酶水解之分,在使用过程中有无区别?

  水解酪蛋白对胚状体、不定芽的分化有良好的促进作用,通常用量在500mg/L,不管是酸解还是酶解,作用都是一样的,酶解更有利于发挥其作用。

  4. 怎么溶解组培常用植物激素?

  IAA、IBA、GA、玉米素、多效唑等应先溶解于少量95%的乙醇中,再加水定容配制成母液;如有结晶析出,可考虑用1/10体积的乙醇溶解后再定容;2,4-D易溶于碱性水溶液,可用少量1mol/L的NaOH溶液溶解后再慢慢加水定容;KT和6-BA先用少量的HCL溶解,再加水定容到一定的浓度。

  5. 细胞分裂素使用浓度?

  一般情况下在培养基中加入0.1~10.0mg/L的细胞分裂素(6-BA/KT/ZT),多数用1.0~2.0mg/L,KT浓度为0.5~2mg/L,这个也要根据实验材料来调整。细胞分裂素可以单独使用也可以与细胞生长素配合使用。

  6. 哪些植物激素能高压灭菌,哪些不能高压灭菌。

  IBA、NAA、6-BA、2,4-D可高温高压灭菌。 IAA、GA3、茉莉酸等不可高温高压灭菌,否则会分解失效,该类植物激素配制母液后需用0.22微孔滤膜过滤除菌,待培养基冷却(50-60℃)后尚未凝胶前加入混匀。

  7. 培养基的pH值会凝胶硬度有无影响。

  有影响。若将培养基pH值调的过高(大于6),则培养基偏硬,增加接种的阻力,会对外植体造成损伤。若将培养基pH值调的过低(小于4.5),则培养基不能凝固,起不到固定外植体的作用。一般将培养基的pH调节至5.5~6.0为宜。

  8. 灭菌过程会否影响培养基的pH值?

  培养基中的蔗糖和激素在高温灭菌过程中容易酸化,培养基pH值灭菌后会有所下降,灭菌前培养基的pH值偏低可能导致培养基不凝或偏软。要求偏酸性的培养基可适当增加琼脂或植物凝胶的用量。

  9. 应用75%的酒精进行种子消毒的过程中需要注意的问题

  种子在消毒过程中使用75%的酒精使用应慎重,酒精渗透力极强,消毒时间过长会直接影响种子发芽率,所以建议消毒时间不应超过1min。

  10. 原始繁殖材料的消毒

  组培中,作为原始繁殖材料的外植体消毒,直接影响整个培养过程的进行。从室外采回来的外植体需进行消毒,首先用自来水冲洗外植体,冲洗时间可根据采集部位不同而定,一般在5~15分钟即可;关键在于在超净台中进行药剂的处理,常用的药剂处理有70%的乙醇溶液、9%的次氯酸钠溶液、和0.1~0.2%的升汞溶液,具体可根据实验材料而定。应注意的是经升汞灭菌的外植体必须用无菌水冲洗6~8次。
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