植物茎段组织培养需要注意哪些问题

　　以茎段进行组织培养比较容易，一般取植物的嫩茎切段作为外植体，切成0.5~1cm长的小段进行接种，保证每个茎段有一个芽点和一片叶子，将芽点部位以下垂直插入培养基凝胶中进行生根培养。

　　外植体接种需要注意的操作事项

　　接种前首先进行灭菌消毒，接种所用的镊子、解剖刀、剪刀等工具需要提前高温高压灭菌，提前10分钟打开超净工作台，灭紫外15~20min，操作人员要用75%的酒精棉球擦手、工作台和器皿，解剖刀和镊子等随时擦酒精灼烧，晾凉后备用。在无菌培养皿中或滤纸上切割外植体，接种到培养基表面，注意瓶口倾斜接近酒精灯火焰。

　　组织培养中材料褐化现象

　　不同品种以及生理状态引起的褐化状态不同。培养基过高浓度的无机盐及高水平细胞分裂素会使褐化现象加重。培养条件不当，例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加重外植体的褐变程度。

　　防治措施：选择合适的外植体。选择生长处于旺盛的外植体，可以使褐变现象明显减轻。合适的培养条件，无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。使用抗氧化剂，在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸、PVP等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。另外使用0.1%~0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。连续转移，对容易褐变的材料可间隔12~24小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7~10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

　　材料玻璃化问题

　　植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状，呈水迹状，这种现象通常称为玻璃化。玻璃化为试管苗的生理失调症，试管苗生长缓慢、玻璃化的嫩茎不宜诱导生根，繁殖系数有所下降。当培养基上细胞分裂素水平较高时，容易出现玻璃化现象。愈伤组织的玻璃化问题主要表现在培养过程中愈伤组织松散，脆易碎。叶子或是长出的愈伤一段时间后在其周围出现水渍化，继而影响整个培养基。

　　防治措施: 在培养基中添加少量聚乙烯醇、脱落酸等物质，降低培养基中细胞分裂素含量及含氮化合物的用量，选用低NH4+水平的B5培养基，都能够在一定程度上减轻玻璃化的现象发生。增加光照，对减轻试管苗玻璃化的现象有明显的作用；在培养基中添加活性炭、马铃薯汁、间苯三酚等可有效的减轻和防止玻璃化。

　　材料水浸状、变色、坏死、茎断面附近干枯

　　可能原因：表面杀菌剂过量，消毒时间过长，外植体选用不当（部位或时期）。

　　改进措施：调换其他杀菌剂或降低浓度，缩短消毒时间，试用其他部位，生长初期取材。

　　材料长期培养几乎无反应

　　可能原因：培养基不适合，生长素的选择和用量不当，植物激素对生长发育和生理过程的调节作用，往往不是某一种植物激素的单独效果。环境温度不适宜。

　　改进措施：更换培养基或调整培养基成分，尤其是调整盐离子浓度；调整激素的种类与配比，增加生长素用量，例如使用人工合成的生长素类似物2，4-D等可有效促进细胞分裂和伸长，新器官的分化和形成；调整培养温度等环境条件。

　　愈伤组织生长过旺疏松

　　可能原因： 由于培养基中激素添加过量，培养室温度偏高，矿物质等无机盐含量不当等因素引起的。

　　改进措施：根据不同的品种、不同组织、不同器官，应适当减少激素用量，适当降低培养温度，调整无机盐（尤其是铵盐）含量，适当提高琼脂用量增加培养基硬度，避免愈伤组织生长过旺和疏松现象发生。

　　愈伤组织生长缓慢太紧密

　　可能原因：细胞分裂素和生长素的用量过多，糖浓度过高。

　　改进措施：减少细胞分裂素用量，调整细胞分裂素与生长素比例，降低糖浓度。

　　愈伤组织分化率低，畸形，分化出的芽多为叶状芽或丛芽，芽生长困难，不易成苗。培养时间长时，再次愈伤组织化

　　可能原因：生长素用量偏高，温度偏高。

　　改进措施：减少生长素用量，可以通过分化培养时在培养基中添加GA3（浓度在0.5~2mg/L之间）解决，并适当降低愈伤组织的培养温度。

　　丛生苗过于细弱，不适于生根或移栽

　　可能原因：细胞分裂素浓度过高或赤霉素使用不当，产生过多的不定芽；温度过高，光照短，光强不足；不及时的转移和分切，生长空间小。

　　改进措施：减少细胞分裂素用量，免用赤霉素；延长光照时间，增强光照；及时转接；降低接种密度；更换透气的封口膜等。

　　组织培养过程中出现黄化

　　引起黄化的主要原因是培养基中Fe的含量不足，各种矿质营养不均衡；培养环境通气不良，瓶内有害气体积累（乙烯、氨气、甲醛）等会引起植物材料黄化脱落；激素配比不当；糖用量不足或长时间不转移；pH值变化过大；培养温度不适；光照不足等。

　　改进措施：改善组培条件，在配制培养基过程中检查仪器设备是否准确；降低组培苗的接种密度，及时转接培养物；使用透气的封口膜改善瓶内通气状况；适当调节pH值、激素配比和无机盐浓度；控制培养室内温度，适当增加光照。