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培养基制作过程中有几个细节问题需要注意

  一、培养基的制备

  (一)母液的配制与保存

  在组织培养数量大,特别是工厂化生产时,为了操作方便,一般先配成高于所需浓度10倍或100倍的母液,用时再稀释10倍或100倍。

  母液配制时注意不能产生沉淀,易沉淀的化合物主要是磷酸钙。另外,硫酸钙和磷酸锰也较易产生沉淀,产生沉淀后一般不可逆转,导致所配溶液不能使用。因此,在配制母液时要避免Ca2+和PO43-、Mn2+和PO43-、Ca2+和SO42-在高浓度下相遇。在混合时要有先后次序,把易产生沉淀的试剂错开,并且一定要在较稀的浓度下混合,混合时要充分搅拌。例如配MS大量元素时有5种试剂,包括KNO3、NH4NO3、MgSO4.2H2O、KH2PO4和CaCl.2H2O。将这5种组分分别用5个烧杯单独溶解,先把前4种加在一起不会产生沉淀,而后加水到将近900ml时再将溶解后的CaCl.2H2O溶液近100ml倒入,定容至1000ml,这样配制不会产生沉淀。

  铁盐必须单独配制,因为铁盐与其他母液混合后易产生沉淀。早期的培养基多采用硫酸亚铁、柠檬酸铁、酒石酸铁和氯化铁等,这些溶液在PH值高于5.2时易形成Fe(OH)3沉淀,不易被植物吸收。现在多采用螯合铁,即把硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠分别溶解后加热混合产生螯合物NaFe-EDTA,不会产生沉淀,易被植物吸收。

  有机成分一般也可配成浓缩100倍的母液。在工厂化生产时,几个有机成分可以混合在一起。但如果生产量较少,有机物好单独配置,因为几种有机成分混在一起后,浓度较高容易发生霉变。

  (二)植物生长调节物质的配置和保存

  组织培养中常用的植物生长调节物质一般都不能直接溶解于水,其配法也有不同。IAA、IBA、NAA、和GA3可先用少量95%酒精溶解,再用温蒸馏水定容;2,4-D可用少许1mol/LNaOH溶解,再加温水定容;6-BA和KT等细胞分裂素可先溶解于少量1mol/L HCL中,再用热蒸馏水定容,如果未溶解好,可将小烧杯放入水浴锅中慢慢加温,轻轻摇动即可溶解。

  生长调节物质的配置浓度可以以1mg/ml为单位,例如称取50mg6-BA,溶解于50ml的蒸馏水中,其浓度为1mg/ml;若取1ml加到1L培养基中,其浓度为1mg/L。配好后装入棕色试剂瓶中,贴上标签,存放在药品保存箱中备用。

  植物生长调节物质价格一般比较昂贵,易氧化变质,配制时不宜一次配的过多或浓度太高,一般配制在1个月内能使用完的量,并保存在低温黑暗处。

  (三)培养基的配置程序

  培养基中的大量元素、微量元素、铁盐、有机成分、生长调节物质以及蔗糖和琼脂粉都分别配备好后,才可配制培养基。

  培养基制作过程中有几个细节问题需要注意:

  第一,煮培养基所用的容器应自制容量刻度标志。

  第二,琼脂好现在蒸馏水中浸泡1小时,加热融化后,再加入培养基的其它成分,后加蔗糖,蔗糖溶解后搅拌均匀及定容,并调节pH值。

  第三,调pH值时,使用1mol/LNaOH(40g NaOH溶解到1L水中)和1mol/LHCL84ml加水定容到1L),多数培养基偏酸,要用NaOH 调节pH值,用酸度计或精密pH试纸测定。通常高压灭菌后酸度会增加0.2左右,在调pH值时应予考虑。

  第四,分装时不要将培养基粘在瓶口或瓶壁上,以免引起污染或不便观察。

  第五,培养基配好后要立即高压灭菌,不能过夜,如果当天消毒不完,应放入冰箱过夜后消毒。

  二、接种室篇

  接种室是对培养的植物材料进行无菌操作的地方,对组织培养的成功与否十分重要。接种室内应有超净工作台、自来水管道、抽气设备、放置培养皿的架子等。

  超净工作台有单人单面、双人单面、双人双面之分,也有垂直送风和水平送风之分。超净工作台由进风口、风机、出风口、无菌工作台面等几部分构成。进风口用于吸附过滤进入风机的空气中的尘埃和脏物。通过进风口的空气进入风机,风机通过出口将风送到出风口。出风口由细菌过滤器封堵,细菌过滤器是超净台的重要部分,它的作用就是吸附空气中99%以上的菌物,出风口出来的风基本上应是无菌的,因此其质量决定了超净台的好坏。从出风口送出的无菌风比较均匀地吹在无菌工作台面的各个部分,一个比较好的超净工作台应该是在台面的各个部分风量的大小基本一致,这样才能保证无菌操作的可靠性。

  可根据工作及房间的情况购置不同类型的超净工作台。工作台的摆放也可根据实际情况灵活处理,但不应该让工作面正对门口或靠门口太近。整个房间好设有缓冲间和双层门窗,以防灰尘和微生物生长。房间内好装有紫外灯或经常喷洒杀菌剂,以抑制过多微生物生长。缓冲间与接种区之间要设立活动门,工作人员在进入接种室之前在缓冲间内更换衣服、鞋帽、穿好工作服,戴上口罩、防尘帽,换上拖鞋才能进入接种区,进入接种区之后随手把活动门关上。在接种区内尽量不让非工作人员进入,工作人员进入后也不可过多走动或在里面玩耍、打闹,更不准在里面吃东西、抽烟,以防污染空气。

  在正式工作之前应将接种室内的紫外灯打开,超净工作台及其上的紫外灯也要提前打开,提前时间至少要20min,但也不可过长,杀菌消毒完成后,关掉紫外灯稍停一段时间再进入室内开始工作,因为紫外灯产生的臭氧对人体有轻微不利。接种完成后,应将接种室清扫干净,换下的衣服、鞋帽、口罩等要及时清洗,并定期进行消毒处理。在没有条件的情况下,接种室可以不设缓冲间,但不能将超净工作台对着门道或窗口放置。接种室好能保持温度的恒定,这样一是有利于工作人员提率;二是可使从培养室内取出的植物材料不会因为温度的过大变动而影响生长。

  三、配药室篇

  植物组织培养需要几十种化学药品,这些药品的质量和保存直接影响到培养效果。保存药品的环境条件严重影响到药品的质量和可用期限,如环境温度、湿度和光照等,为了满足这些条件,建立一个单独的配药室是必要的。配药室的大小可根据药品的多少和今后发展的规模确定,但不可太小,好能终年保持相对较低温度,且应有较好的通风干燥条件,同时又能遮光以防止药品受到太阳光直晒,因为一些药品在受到高温、高湿和阳光照射时,容易挥发、潮解、失效、变质。在配药室内应有几个药品柜,将固体药品和液体药品分开,大包装与小包装分开,常用药品与不常用药品分开,危险、易燃、易爆、有腐蚀性的药品与普通药品分开。药品柜结构设计要较为合理,药品的摆放应按一定的顺序,这样看起来一目了然,十分便利于工作。同时还应建立药品购进和使用档案,记录药品的购进日期、数量,取用的数量、日期及使用人员等,以利于工作的开展。

  在药品的质量上,用于组织培养研究的化学药品除非特殊指明外都应该是分析纯或更好的,不能用化学纯的。用于植物大规模工厂化繁殖的药品,为了节约经费,降低成本,在经过认真的预备实验之后可选用部分低价的化学纯试剂或市售药品。药品生产的厂家与药品的质量有直接关系,为了实验的准确性、可重复性和可延续性,好固定购买某些厂家的某些药品,一般来说进口药品的质量好于国产的药品,虽然价格高些,但从节约时间和减少重复以及提高实验的准确性等方面综合考虑,总体算起来未必不划算。

  在配药室内,除药品柜外还应有一个实验台,实验台必须牢固、平稳,具有较好的抗震性能,因为在实验台上要摆放一台万分之一的电子天平和一台百分之一的电子天平。在实验台的抽屉内存放称量药品用的药匙、称量纸、毛刷、卫生纸等。毛刷用于及时清扫天平上和天平周围实验台上散落的药品,用于清扫天平的毛刷一定要柔软,且不易掉毛。卫生纸用于擦拭药匙,宜选用柔软、纤维较长、质量较好的,质量不好的卫生纸含尘量和含菌量都较高,可能会给实验室带来意想不到的影响。称量纸应用专用纸,不可随便找一些粗糙不干净的纸张,更不可用报纸代替。是内还应放一台大容量的药品保存箱,好是分层式的,以便于用来分门别类得保存激素、抗生素和各种需要低温保存的物品。一些易燃、有毒的药品好单独粗放,可在配药室的一角设置一个通风橱,以存放这些特殊药品和进行特殊操作。配药室内还可存放一些干燥的、暂时不用或利用率较低的玻璃器皿或其他实验用品,如脱脂棉、滤纸、纱布等,这些物品应单独存放在一个橱子内或。

  组织培养所需要药品存放要求:

  1、可室温常规存放的化学药品

  这类药品多为无机物,性质比较稳定,不易受到微生物的侵染和温度的影响,所以可以在室温下存放。主要有:硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾等。

  2、宜于零上低温存放的化学药品

  这类药品多为有机物,易受到微生物的侵染,也对温度比较敏感,所以好在低温下存放。主要有肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、抗坏血酸、生物素等。

  3、应当在-20℃下保存的药品液体抗生素等。
来源:网络
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